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目前,在全世界35个国家肺癌的发病率和死亡率已经排在各种恶性肿瘤的第 1 位。在过去的10年中，全球肺癌的发病率每年以22%的速度上升，每年全球新增肺癌患者达120万人，死亡110万人。在我国肺癌属于高发病率肿瘤，死亡率较高[1-3]，其预后与临床分期密切相关。Ⅰ期肺癌患者5年生存率为90%,而Ⅱ～Ⅳ期患者的5年生存率则由40%下降至5%[4]。近20年来虽然肺癌治疗手段增多，治疗水平不断提高，但5年生存率仍甚低。患者就诊时发现的肺癌多数为中晚期，因而如何对肺癌高危人群进行筛查和对病变进行早期诊断是提高肺癌患者5年生存率的关键。
早期肺癌的筛查多选用胸部X线(CXR)进行，但多项大型临床试验却并未证实其能降低肺癌的死亡率[5-7]。90年代中期，随着低剂量螺旋CT (LDCT) 的出现，人们又开始对于能否应用LDCT进行肺癌的筛查发生了兴趣。LDCT以低于常规CT的剂量获得了与常规CT相同的敏感性，但剂量仅为普通CT的1/6[8]，对机体组织损伤更小，更有利于进行筛查。而近年来的一项肺癌筛查随机临床试验发现LDCT在肺癌的筛查中优于胸部X线检查[9]，为应用LDCT进行筛查提供了一定的依据。
p16基因的甲基化是肺癌发生的早期事件，而对于外周血中p16基因甲基化的检测可能有助于肺癌的早期诊断[10]，为我们进行肺癌的筛查提供了新的手段。由于LDCT在肺癌筛查中的假阳性表现，我们于2006年1月起在江苏省省级机关医院利用LDCT联合外周血p16基因甲基化检测对肺癌高危人群进行了筛查，并对此方案的可行性进行了分析。
1 材料与方法
1.1 对象
1.1.1 肺癌高危人群，入组标准：男性，年龄55-75岁；吸烟指数≧20年包，目前仍在吸烟或戒烟不超过10年。排除标准：有肺癌病史；近12个月有胸部X线和CT检查史；正在行肿瘤相关治疗；有肺叶或全肺切除史。共523例，以年龄及吸烟史为分层因素进行随机分组，LDCT-p16甲基化组262例，CXR组261例。LDCT-p16甲基化组平均年龄67±4.3岁，CXR组65±4.7岁(P﹥0.05）两组吸烟史构成详见表1。
1.1.2 主要试剂：DNA提取试剂盒采用QIAamp Blood Mini Kit(QIAGEN，德国)，DNA纯化试剂采用Wizard DNA 纯化试剂盒(美国Promega 公司)，PCR反应液、dNTP、Taq聚合酶购至美国Promega 公司，引物由上海生物工程公司合成。引物序列[11]：U 上：5’- TTAT TAGA GGGT GGGG TGGA TTGT -3’，U下：5’-CAAC CCCA AACC ACAA CCAT AA -3’，M上：5’- TTAT TAGA GGGT GGGG CGGA TCGC -3’，M下：5’- GACC CCGA ACCG CGAC CGTA A -3’。其中U为非甲基化引物，M为甲基化引物。
1.1.3 主要仪器：PCR扩增仪为美国MJ公司，电泳仪、凝胶成像系统为北京六一电子仪器设备厂产品。螺旋CT为Marconi UltraZ型，X线摄片机为德国西门子公司，型号为Multix-Top。
1.2 方法
1.2.1 LDCT扫描 管电压120 kV，电流50 mA，扫描时间0.9 s，准直器宽度5.0 mm，螺距1.5，从胸廓入口至肺底连续扫描。CT图像用肺窗和纵隔窗两种窗观察。肺窗的窗宽1200Hu，窗位-600Hu；纵隔窗的窗宽400Hu，窗位35Hu。所有病人的CT片均由2位胸部放射学专家在不了解病人临床表现的情况下分别独立、随机阅片，并记录每例CT表现，进行讨论，意见统一为最终结果；意见不统一时由第三位放射科主治医师阅片，共同讨论后最后得出共同结果。观察内容包括：肺结节的大小、位置、形态、密度、数目以及每幅图像伪影的有无、伪影是否影响诊断等。
1.2.2 CXR参数 管电压为120kV，管电流由机器自动设定，靶片距约为180cm。
1.2.3 血清p16 基因启动子区甲基化检测
1) 血清DNA的抽提：采用QIAamp Blood Mini Kit，根据血液和体液方案稍作修改完成。向微量离心管中加入200 μl血清，20 μl Qiagen蛋白酶溶液，200 μl 缓冲液AL，56 ℃孵育10 min，加200 μl 无水乙醇，将之混匀后转移至QIAamp 离心柱中，离心6 000 ×g，1 min，弃去滤液。重复上述步骤，至血清使用量为2 ml。往柱中加入500 μl缓冲液AW1，离心6 000 ×g，1 min，弃去滤液。再次用500 μl 缓冲液AW2 洗涤，离心20 000 ×g ，3 min。最后用50 μl缓冲液AE 洗脱QIAamp 柱上的DNA，室温放置20 min，离心20 000 ×g，3 min。
2) 血清DNA的亚硫酸氢盐修饰：取含DNA（1 μg）溶液50 μl，加入4 mol/ L 的NaOH 至终浓度为0. 2 mol/ L，37 ℃变性10 min。加入30 μl新配制的10 mmol/ L的氢醌及520 μl，pH 5. 0 的3 mol/ L 的NaHSO3，表面覆盖矿物油，避光置于50 ℃水浴16 h 。然后利用Wizard DNA 纯化试剂盒纯化修饰后的DNA。于室温下加入4 mol/ L的NaOH至终浓度为0. 3 mol/ L ，放置5～20 min脱硫。最后加入17 μl 10mol/l的醋酸铵和3倍体积的冰乙醇-20 ℃淀DNA，室温下干燥，加适量去离子水溶解，- 20 ℃保存。
3） 甲基化特异性PCR 扩增:扩增条件具体参照文献[11]。扩增条件：95 ℃预变性5 min，冰浴冷却后,加入Taq 聚合酶2. 0 U。p16 非甲基化扩增条件：95 ℃30 s，62 ℃30 s，72 ℃ 30 s ，35个循环，最后1 个循环72 ℃延伸4min。p16 甲基化扩增条件：95 ℃30 s，60 ℃30 s，72 ℃30 s，35个循环,最后1 个循环72 ℃延伸4min。8 %聚丙酰胺电泳,溴化乙锭染色，紫外灯下观察结果。
1.2.4 结果判断
1) LDCT结果判断：(1)肺内结节与肿块，发现非钙化结节或肿块时能排除血管断面所致者记为发现病变。观察病灶形态、病灶-肺交界面、病灶内结构。具有分叶、密集细毛刺、乳晕征、空泡征等1项或2项征象者记为可疑恶性，具有2项以上且无明显粗大钙化者记为肯定恶性，以上2种结果均记为阳性。而病灶呈圆形或卵圆形或多角形者或有明显斑块状钙化者记为阴性。(2)Ⅰ～Ⅳ级支气管，:观察管腔大小、管壁厚度与表面改变，管腔狭窄或中断、管壁毛糙、管壁增厚、管内外结节记为阳性。能排除肺外原因、异物等引起之肺不张也记为阳性。
2) CXR结果判断：胸片上可见结节或团块影，纵隔淋巴结肿大(包括钙化结节)，能排除肺外原因、异物等引起之肺不张以及胸膜团块影等记为阳性。
3) p16甲基化结果判断：甲基化引物检测的标本中扩增出特异性带，则记为p16基因甲基化阳性。
4) 筛查结果判断：所有阳性病例俱应行纤维支气管镜、穿刺活检等病理检查或手术病理确诊。而对于暂不能或拒绝行相应检查者，应密切随访。
（作者：江苏省省级机关医院）
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